Les interactions in vitro/in vivo du graphène nanopores (PNB) ont été évalués.•

Les résultats in vitro ont montré que les PNB induisait une apoptose précoce dans les cellules cancéreuses.•

De manière cruciale, nous avons étudié la toxicité in vivo des GNP chez le rat.•

Les GNP ont causé une toxicité subchr chronique à nos doses testées (5 et 15 mg / kg) chez les rats.•

Les GNP sont susceptibles d’avoir une faible biodisponibilité dans les cellules cancéreuses du poumon et les rats.

Abstrait

En tant que membre archétypal monocouche peu coûteux de la famille du carbone, le graphène a déclenché une nouvelle « ruée vers l’or » en nanotechnologie pour obtenir des propriétés uniques qui n’étaient pas disponibles dans de nombreux matériaux traditionnels. En raison de ces caractéristiques uniques, les matériaux liés au graphène trouvent de nouvelles utilisations en nanomédecine et en biologie synthétique, en plus de leurs diverses applications en électronique, optoélectronique, photonique et nettoyage de l’environnement. L’augmentation de la production de nanostructures de graphène et la probabilité accrue d’exposition à ces substances dans les milieux environnementaux et professionnels ont soulevé des préoccupations quant aux effets néfastes sur la santé. En particulier, les effets biologiques de ces matériaux doivent être évalués afin d’assurer un développement durable et sans risque du graphène pour des applications généralisées. Dans ce travail, pour la première fois, nous avons étudié les interactions in vitro et in vivo d’un dérivé relativement nouveau du graphène, les nanopores de graphène (PNB) dans les systèmes mammifères, afin d’élucider systématiquement le mécanisme possible de leur toxicité dans le temps. Cette étude a montré que les PNB induisait une apoptose précoce dans les cellules cancéreuses du poumon SKMES-1 et A549. Cependant, l’apoptose tardive n’est induite qu’à des concentrations supérieures à 250 μg/ml, ce qui suggère que, bien que les PNB à des concentrations plus faibles induisent une régulation à la hausse de la phosphatidylsérine sur la membrane de la surface cellulaire (c’est-à-dire un événement apoptotique précoce), les PNB ne désintègrent pas de manière significative la membrane cellulaire. Nous avons également montré que les rats injectés par voie intrapéritonéale avec des GNP souffraient d’une toxicité subchr chronique sur une période de 27 jours lorsqu’ils étaient testés à des doses uniques et multiples de GNP (5 et 15 mg / kg), comme en témoignent la biochimie sanguine, l’indice organo-somatique, l’analyse des fonctions des enzymes hépatiques et rénales, les biomarqueurs du stress oxydatif et les examens histologiques. En résumé, nos résultats montrent que les GNP sont susceptibles d’avoir une faible biodisponibilité dans les cellules cancéreuses du poumon SKMES-1 et A549 et les rats. Néanmoins, cela doit être considéré dans le contexte d’un manque plus large de connaissances concernant la biodisponibilité, le devenir et le comportement de ce type de nouveau cadre poreux du graphène dans les systèmes naturels. Par conséquent, un régime d’exposition aux PNB à plus long terme, plus pertinent pour les conséquences environnementales réelles, est nécessaire pour déterminer pleinement les capacités de transport des PNB dans les systèmes vivants.

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Mots-clés

Nanopores de graphèneCytotoxicitéTest in vivo Testinvitro AdministrationintrapéritonéaleBiocompatibilité

1. Introduction

Le graphène est devenu une « superstar » en nanomédecine avec des applications pour améliorer les diagnostics, les thérapies et les facteurs de risque génétiques, en raison de ses propriétés multiformes telles que la petite taille, le grand rapport surface/volume, les effets de taille quantique et les propriétés physico-chimiques uniques [1], [2], [3]. Un avantage important des matériaux à base de graphène est leur capacité à traverser efficacement les barrières biologiques telles que la barrière hémato-encéphalique, soulignant leur potentiel en tant que véhicule d’administration de médicaments pour les agents thérapeutiques anticancéreux. En particulier, l’amélioration combinée de la perméabilité et de l’effet de rétention faciliterait leur accumulation dans les tumeurs, libérant des niveaux thérapeutiques de médicaments dans les cellules cibles avec des effets secondaires réduits [4]. Typiquement, les points quantiques de graphène ont de nombreuses propriétés bien supérieures aux points quantiques conventionnels tels que la photoluminescence,la faible toxicité et l’interaction entre la taille et les caractéristiques optiques qui ont été utilisés comme outils d’imagerie diagnostique ainsi que la thérapie photodynamique / photothermique [5]. Une utilisation similaire de la mousse de graphène tridimensionnelle pour la thérapie par cellules souches des accidents vasculaires cérébraux et de ses bioconjugués en médecine régénérative a été décrite dans la littérature récente [6]. Récemment, les nanopores de graphène (PNB) ont également été utilisés dans des applications telles que le séquençage de l’ADN [7], [8], [9] et le traitement de l’eau [10], [11] et les PNB ont fourni des cadres poreux uniques [12]. Des biointerfaces poreuses de graphène ont également été récemment rapportées comme des agents antimicrobiens efficaces avec des activités bactéricides très efficaces contre les bactéries Gram positif et Gram négatif [13] , [14]. Matharu et al. [15] ont rapporté les effets des fibres polymères chargées de nanoplaques de graphène sur la croissance microbienne de deux bactéries à Gram négatif Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa. Ils ont déterminé la concentration minimale inhibitrice de fibres de graphène qui, à son tour, peut produire les effets antibactériens les plus élevés tout en restant non toxique pour les cellules normales. Cette étude a révélé que 8 % en poids des fibres de graphène présentaient de bons effets antibactériens en raison du contact direct entre les cellules bactériennes et les arêtes vives des nanostructuresdu graphène. Ce contact direct est également responsable d’une déformation sévère de la membrane et de l’efflux de matériel cytoplasmique [16]. L’un des inconvénients de l’utilisation des PNB est que très peu de techniques de synthèse sont disponibles. Cependant, des techniques telles que l’irradiation par faisceau d’électrons, le bombardement ionique, le dopage, la modélisation, la gravure chimique, le dépôt chimique en phase vapeur et d’autres méthodes chimiques ont maintenant été utilisées pour leur préparation [9], [17], [18], [19], [20]. Les inconvénients de ces méthodes sont le faible rendement de production et les problèmes associés à leur séparation/purification. Pour remédier à cette omission, nous avons récemment rapporté une étude démontrant une approche nouvelle et facile de la synthèse des GNP par traitement thermique de l’oxyde de graphène réduit sans utiliser de catalyseur ou d’approche basée sur un modèle [21].

Le PNB, un matériau mince et flexible doté d’une excellente antabilité électrique et de propriétés mécaniques robustes, est prometteur pour la détection de protéines sans étiquette, le séquençage de l’ADN et la décontamination micropolluante à base d’eaux usées à haut débit [7], [8], [9], [10], [11]. La surface spécifique élevée et le cadre nanoporeux permettent la détection directe et le séquençage de biomolécules à l’échelle atomique. Ces dernières années, l’internalisation cellulaire et le transport trans-barrière des nanofeuilles de graphène micro/mésoporeux ont fait l’objet de développements majeurs en nanobiotechnologie. Il est évident que les matériaux à l’échelle nanométrique d’un diamètre inférieur à 100 nm peuvent pénétrer dans les cellules, tandis que les nanoparticules de moins de 40 nm de diamètre peuvent atteindre les noyaux cellulaires. Les particules dont le diamètre est inférieur à 35 nm sont capables d’atteindre le cerveau en traversant la barrière hémato-encéphalique [22], [23], [24], tandis que les nanoparticules plus grosses sont exclues, ce qui réduit à son tour l’administration de nanoparticules théranostiques [25], [26], [27]. Une meilleure sous-estimation des propriétés physico-chimiques du graphène, de l’interaction entre le graphène et les cellules et des mécanismes de toxicité possibles est d’une importance cruciale pour décrire les applications biomédicales potentielles de ces matériaux. Le mécanisme proposé de toxicité des PNB est illustré à la Fig. 1. L’utilisation généralisée de matériaux à base de graphène et leurs effets toxiques potentiels sont susceptibles d’exacerber plusieurs problèmes de santé [26] , [27]. La plupart des expériences de laboratoire portant sur les applications potentielles des GNP dans les sciences de la vie n’ont pas pris en compte la toxicité associée aux GNP dans leurs régimes d’essai. Récemment, cependant, quelques études ont examiné les implications toxiques in vitro et in vivo de la mousse de graphène tridimensionnelle pour étudier la biodisponibilité et le potentiel de toxicité subséquent [28] , [29]. Les risques précliniques, les effets néfastes de l’exposition aux PNB et les approches visant à minimiser leurs dangers pour la santé restent indéfinis. Cependant, l’inhalation de structures en graphène est considérée comme un facteur de risque de maladie cardiorespiratoire. Par exemple, les nanoplaques de graphène inhalées peuvent être transportées profondément dans les régions distales des poumons et déclencher une inflammation chronique des voies respiratoires [30]. On pense généralement que le placenta, les poumons, le tractus gastro-intestinal et la peau agissent comme des barrières majeures pour l’entrée de nombreuses nanostructures dans les organismes vivants [31]. En effet, une étude récente sur des souris a démontré que le graphène à faible couche administré par voie intratrachéale était principalement retenu dans les poumons, avec 47% restant après 4 semaines, ce qui entraînait des lésions pulmonaires aiguës dose-dépendantes et un œdème pulmonaire [32]. Une étude in vitro des effets du graphène et de l’oxyde de graphène sur la peau humaine HaCaT kératinocytes a démontré que le graphène oxydé était le plus cytotoxique, induisant des lésions mitochondriales et plasmiques, et suggérant de faibles effets cytotoxiques au niveau de la peau [33]. La réduction de l’oxyde de graphène est plus toxique que l’oxyde de graphène, comme en témoignent de nombreuses études rapportées récemment [34] , [35]. Cela est principalement dû à ses arêtes vives et à sa morphologie structurelle. Contrairement aux nanoparticules typiquement solubles examinées dans les études toxicologiques conventionnelles, les nanostructures de graphène ont des formes et des surfaces différentes, ce qui peut à son tour influencer de manière significative leur diffusion, leur dispersion, leur agrégation et leur agglomération dans le plasma. Il est important de se rendre compte de ces caractéristiques « accordables » du graphène pour expliquer les différents résultats toxiques sur les tissus. In vivo, à la suite d’essais de toxicité du graphène, des examens histologiques post-mortem des altérations hépatiques ont révélé une hypertrophie des hépatocytes, une nécrose et une infiltration cellulaire inflammatoire dans les tissus hépatiques et rénaux [36]. Le niveau de fonction des organes et le stress oxydatif ont été signalés pour affecter le devenir, le transport et la toxicité du graphène dans les organes, mais il y a actuellement un manque de cohérence à cet égard [36]. Les fonctions enzymatiques hépatiques peuvent être utilisées pour révéler les schémas de biodistribution, de métabolisme et d’excrétion du graphène. De même, l’étude des indicateurs de stress oxydatif est un mécanisme couramment reconnu adopté pour étudier les lésions cellulaires chez les mammifères. Les antioxydants agissent comme un système de défense pour rétablir l’équilibre redox cellulaire lorsque le stress oxydatif est généré à la suite d’une production excessive d’espèces réactives de l’oxygène. La perturbation de cet équilibre critique en présence d’espèces réactives excessives de l’oxygène déclenche l’activation et la promotion d’une cascade pro-inflammatoire, qui à son tour peut provoquer la libération mitochondriale de facteurs proapoptotiques pouvant entraîner la mort cellulaire. Les hépatocytes sont des cibles clés pour les dommages causés aux espèces réactives de l’oxygène, et donc la fonction hépatique et les biomarqueurs des stress oxydatifs doivent être étudiés avec le plus grand soin.

Les lignées cellulaires du cancer du poumon sont couramment utilisées pour évaluer la cytotoxicité d’un matériau expérimental pour des applications biomédicales. Des lignées cellulaires cancéreuses telles que le poumon et le sein ont été sélectionnées par le National Cancer Institute comme modèles pour dépister les médicaments / composés en prélude à des tests dans des xénogreffes ou des modèles animaux [37]. L’utilisation de lignées cellulaires humaines dans les essais de toxicité nous permet de tester sélectivement les mécanismes de toxicité cellulaire dans un environnement contrôlé, ce qui peut être très difficile, long et laborieux à réaliser dans des modèles de rats. En outre, les modèles animaux sont génétiquement très différents de ceux de l’homme. L’expérience de biodisponibilité avec des modèles animaux ne peut pas expliquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions entre la membrane cellulaire ou les organites cellulaires et les composés testés, ce qui ne peut être réalisé qu’en utilisant des lignées cellulaires humaines bien définies et bien caractérisées telles que les cellules du poumon et du cancer du sein. Isoler la cellule humaine primaire pour chaque organe pour une étude in vitro n’est pas rentable et peut également produire une énorme variabilité en raison de l’hétérogénéité significative chez les humains sur les niveaux génomique, protéomique et phénotypique. Les lignées cellulaires cancéreuses humaines contiennent des informations génétiques bien caractérisées et traduisibles pour les études humaines. De plus, l’utilisation de lignées cellulaires cancéreuses humaines pour tester la toxicité in vitro nous donne une indication de la gamme de doses qui peuvent être appliquées dans des modèles animaux. In vivo,l’efficacité des traitements reste non sélective, non spécifique et est réalisée dans un environnement incontrôlé (par exemple des souris génétiquement hétérogènes). Ainsi, nous avons utilisé des lignées cellulaires humaines in vitro pour mener nos expériences préliminaires de toxicité dans un environnement contrôlé et 2D, qui ont ensuite été répétées dans des modèles in vivo pour mieux comprendre l’effet du composé dans un environnement 3D non contrôlé. Nous avons étudié deux types de cellules cancéreuses du poumon (par exemple, l’adénocarcinome et le carcinome épidermoïde – tous deux d’origine épithéliale) pour deux raisons: (a) les cellules cancéreuses évoluent pour échapper au système immunitaire et présentent une résistance à un certain nombre de réponses thérapeutiques telles que la chimiothérapie et la radiothérapie, et possèdent donc un défi thérapeutique. En raison de l’exposition professionnelle de ces nanomatériauxà base de graphène, il est fort probable que ces nanomatériaux puissent être inhalés chez l’homme, ce qui peut entraîner une pathologie respiratoire. Ainsi, tester les effets toxiques de cette nanoparticule dans des lignées cellulaires de cancer du poumon était avantageux par rapport à l’utilisation de lignées cellulaires somatiques; et b) la prolifération illimitée est une caractéristique prédominante de toutes les lignées cellulaires cancéreuses par rapport à la capacité proliférative limitée des cellules somatiques. Pendant le passage, les cellules somatiques subissent des anoikis lorsqu’elles se détachent du revêtement de la matrice extracellulaire, ce qui entraîne une diminution du nombre de cellules dans le passage suivant. Par conséquent, la mort cellulaire résultante due au composé d’essai peut ne pas être une représentation fidèle de la toxicité d’un composé. De plus, à mesure que le nombre de passages augmente, les cellules somatiques peuvent devenir moins sensibles à un assaut thérapeutique exogène. Ces phénomènes sont rarement observés ou sont absents dans les cellules cancéreuses.

De toute évidence, les études in vitro et in vivo sur la toxicité des nanostructures de graphène deviennent de plus en plus importantes. En réponse à cela, la présente étude étudie les effets toxiques des GNP sur les cellules cancéreuses du poumon (SKMES-1 et A549) in vitro et chez le rat in vivo, enparticulier, des analyses biochimiques, des analyses enzymatiques sériques, une numération globulaire complète ainsi que des analyses histologiques ont été utilisées dans cette étude.

2. Résultats

2.1. Effets toxiques in vitro des PNB sur les cellules cancéreuses du poumon

Des images FACS représentatives et l’analyse d’une expérience de viabilité cellulaire ont été montrées à la Fig. 2. Fig. 3 A démontre qu’après une exposition de 24 heures aux PNB, la viabilité cellulaire des cellules A549 a présenté une réduction significative dose-dépendante de 50 à 500 μg/ml. Par exemple, après 24 heures, la réduction du pourcentage de cellules vivantes était de 52,8 %, 42,5 % et 33,2 % aux concentrations de 50, 250 et 500 μg/ml respectivement, comparativement au groupe témoin (0 μg/ml, ∼80 %). Une observation similaire a été faite dans les cellules SKMES-1 où les concentrations de GNP 50 et plus ont induit une réduction significative des cellules vivantes. Cependant, la réduction n’était pas dose-dépendante (Fig. 3A). Par exemple, à 50, 250 et 500 μg/ml de PNB, le pourcentage de cellules vivantes était de 50,8 %, 46,5 % et 47,4 % respectivement, comparativement au groupe témoin (0 μg/ml, 70 %). Le nombre de cellules subissant une apoptose précoce a considérablement augmenté de manière dose-dépendante après un traitement avec des PNB de 5 μg à 500 μg/ml dans les cellules A549 et SKMES-1(Fig. 3B). Une augmentation dose-dépendante des cellules apoptotiques tardives(Fig. 3C) et nécrotiques(Fig. 3D) a également été observée dans les cellules A549, bien qu’aucune augmentation significative de la nécrose n’ait été observée dans la lignée cellulaire SKMES-1.

2.2. Effets des PNB sur le poids corporel et relatif des organes

La toxicité in vivo des GNP a été évaluée chez le rat après des injections intrapéritonéales répétées de 27 jours. Le traitement par GNP n’a pas affecté le poids corporel des rats traités pendant la période d’exposition de 27 jours pour un traitement avec 5 mg/kg de poids corporel, soit une fois, soit plusieurs doses (Fig. 4). Aucune diminution significative du poids corporel n’a été observée chez les rats ayant reçu des PNB jusqu’à 5 mg/kg. Les rats du groupe à fortes doses répétées (15 mg / kg de poids corporel) ont montré un poids corporel inférieur après 27 jours (Fig. 4) par rapport au groupe témoin, mais cela n’a pas atteint la signification. Les indices organo-somatiques ont démontré que le poids des organes ne changeait pas par le traitement des PNB, par rapport au témoin, ce qui confirme leur faible toxicité in vivo (Informations supplémentaires Fig. 2).

2.3. Effets des GNP sur la numération globulaire complète chez le rat

Pour examiner la cytotoxicité in vivo des PNB, nous avons effectué une numération globulaire complète (FSC), des enzymes de la fonction hépatique et rénale, des biomarqueurs du stress oxydatif et une étude histologique des organes vitaux des rats témoins et traités. Animaux traités reçus avec 5 ou 15 mg de PNB/kg de poids corporel sous forme de dose unique ou de doses répétées (8 doses réparties sur une période de 27 jours). Les effets toxiques des GNP sur le CBC n’ont pas été observés (Fig. 5A–O) bien qu’il y ait eu une légère réduction (6%) du nombre de plaquettes dans le groupe 15 mg/kg (Fig. 5K). La proportion de lymphocytes est restée stable (Fig. 5B) et le nombre total de globules blancs n’a pas été affecté (Fig. 5N).

2.4. Analyse de la fonction hépatique et rénale

Des altérations ont été observées dans les fonctions hépatiques et rénales après un traitement par GNP (Fig. 6), c’est-à-dire que les résultats ont montré que les activités des enzymes ALT, AST, ALP étaient significativement augmentées dans tous les groupes, suggérant des lésions hépatiques. Les taux de créatinine, révélateurs de lésions rénales, n’ont été significativement augmentés que chez les rats traités avec 15 mg / kg de GNP à doses répétées.

5.8. Oxidative stress biomarkers and antioxidant enzymes

Les activités des enzymes antioxydantes, c’est-à-dire l’activité de la catalase, l’activité de la superoxyde dismutase, l’activité de la glutathion-S-transférase et la peroxydation lipidique, ont été mesurées. Pour déterminer ces paramètres dans le foie, le foie a été rapidement retiré, lavé dans une solution saline isotonique glacée et épaté individuellement sur du papier filtre sans cendres. Les tissus ont ensuite été homogénéisés dans un tampon Tris-HCl de 0,1 M, pH 7,4, à l’aide d’un homogénéisateur Potter-Elvejham à 4 °C avec un facteur de dilution de 4, l’homogénat tissulaire brut a ensuite été centrifugé à 10 000 tr/min pendant 15 min à 4 °C et le surnageant a été maintenu à −20 °C pour l’estimation de l’analyse de l’activité enzymatique [51]. La concentration de peroxydation lipidique du produit final (MDA) dans l’homogénat du tissu hépatique (50 mg de tissus dans 1,5 ml de tampon tris-HCl de 0,1 M, pH 7,4) a été déterminée par la méthode rapportée par Okhawa et al. [52]. En bref, le mélange réactionnel contenait 0,2 ml d’homogénat tissulaire à 10 % (p/v), 0,2 ml de dodécylsulfatede sodium à 8,1 %, 1,5 ml d’acide acétique à 20 % et 1,5 ml de solution aqueuse d’acide thiobarbutarique (TBA) à 0,8 %. Le pH de 20 % d’acide acétique a été préré ajusté avec 1 M de NaOH à 3,5. Le mélange a été composé jusqu’à 4 ml avec de l’eau distillée et chauffé à 95 °C pendant 1 h, au bain-marie en utilisant une boule de verre comme condenseur. Après refroidissement dans l’eau du robinet, 1 ml d’eau distillée et 5 ml de mélange de n-butanol et de pyridine (15:1) ont été ajoutés et le mélange a été agité vigoureusement sur un mélangeur vortex (Bio Vortex, peQ Lab, Royaume-Uni). Après centrifugation à 4000 tr/min pendant 10 min, l’absorbance de la couche organique supérieure a été lue à 532 nm. Le tétraméthoxy-propane (TMP) a été utilisé comme étalon externe, et le niveau de peroxydation lipidique a été exprimé en nmol de MDA. Les valeurs de la peroxydation lipidique ont été exprimées en nmol/poids protéique des tissus. Le glutathion réduit (GSH) a été estimé selon la méthode décrite dans la réf [53]; catalase [54]; et les hydroperoxydes lipidiques [55]. L’estimation des hydroperoxydes lipidiques a été effectuée selon la méthode rapportée par Jiang et al. [55], dans laquelle 0,1 ml d’homogénat tissulaire à 10 % (p/v) a été traité avec 0,9 ml de réactif de renard (88 mg d’hydroxytoluène butylé, 7,6 mg d’orange xylénol et 9,8 mg de sulfate de fer d’ammonium qui ont été ajoutés à 90 ml de méthanol et 10 ml d’acide sulfurique 250 mM) et incubés à 37 °C pendant 30 min. La couleur développée a ensuite été lue à 560 nm et les hydroperoxydes lipidiques ont été exprimés en mM/g de tissus.

5.9. Analyse statistique

Les données ont été analysées statistiquement dans GraphPad Prism 5.04 pour déterminer les effets du traitement GNP sur divers paramètres du nombre de cellules, du poids corporel, des tests de la fonction hépatique et rénale, de la numération globulaire complète et des biomarqueurs du stress oxydatif. p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Les résultats ont été présentés comme la moyenne ±’écart-type (ET).

Reconnaissance

Ce travail a été soutenu par le Centre EPSRC pour la formation doctorale en métamatériaux,XM² [N° de subvention EP/L015331/1] l’Université d’Exeter EX4, Royaume-Uni et FORCE Cancer Charity [Grant No. 50703] Royaume-Uni.Données supplémentaires

Les données supplémentaires associées à cet article peuvent être trouvées, dans la version en ligne, à doi:10.1016/j.apmt.2018.07.005.